Оптимизация условий реакции для достижения высокого выхода стевии ребаудиозида D
Диеты с высоким содержанием сахара привели к росту числа различных хронических заболеваний, включая ожирение, диабет, сердечно-сосудистые заболевания и гипертонию, что представляет собой серьёзную глобальную проблему общественного здравоохранения. Стевия ребаудиосайд D (Reb D), натуральный подсластитель из растений, привлекла значительное внимание как заменитель сахара благодаря нулевому содержанию калорий, насыщенной сладости и приятному вкусовому профилю.
Однако ограниченное её присутствие в stevia rebaudiana Bertoni и проблемы, связанные с низкой растворимостью и ферментативной активностью растительной гликозилтрансферазы, препятствовали её широкому коммерческому применению. В ответ на эти проблемы была обнаружена новая гликозилтрансфераза под названием YojK, происходящая из Bacillus subtilis 168. В данном исследовании введена генетически модифицированная бактериальная гликозилтрансферазу YojK-I241T/G327N, характеризующуюся высокой растворимостью и каталитической эффективностью, предоставляющей большой потенциал для промышленного производства Reb D.
Разработка высокоэффективного метода получения ребаудиозида D с использованием каскадной реакции ферментов YojK-I241T/G327N и AtSuSy.
To address the issue of low solubility in plant-derived glycosyltransferases, researchers investigated the potential of using YojK, an O-glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168. YojK was chosen because of its demonstrated glycosylation activity with various substrates, including large molecules. After successful recombinant expression and purification, YojK was employed to glycosylate Reb A, resulting in the production of Stevia Reb D. Enzyme kinetic analysis revealed that YojK has lower catalytic activity toward Reb D compared to other glycosyltransferases. Consequently, the study suggests the necessity for structure-guided engineering to enhance YojK's catalytic activity for potential practical applications. (as shown in Рисунок 1)
Рисунок 1
Оптимизация реакционных условий для достижения высокого выхода ребаудиозида D.
The reaction conditions, including pH, temperature, and substrate concentration, can be optimized to achieve a high yield of Srevia Reb D. The study used molecular dynamics simulations to investigate how the YojK-I241T/G327N variant enhances Reb D glycosylation. The variant maintained a stable hydrogen bond between Reb A and H14 during simulations, unlike the wild-type(as shown in Рисунок 2). This stability also extended to the distance between Reb A's O2 atom and UDPG's C1P. The YojK-I241T/G327N variant's improved catalytic efficiency was attributed to these stable interactions, suggesting its practical potential.
Рисунок 2
Рисунок 3
Заключение
Этот подход дал 83,47% Reb D. Примечательно, что добавление 1 мМ UDPG позволило синтезировать 20,59 г/л Reb D с впечатляющей выходностью 91,29%, превзойдя предыдущие исследования. Этот процесс демонстрирует потенциал промышленного производства Reb D, особенно после строительства YojK.YojK может эффективно экспрессироваться в E. coli BL21 (DE3) с высокой растворимостью. С помощью инженерии, управляемой структурой, был создан двойной мутант YojK-I241T/G327N, что позволило массово производить Reb D с исключительным выходом 91,29% за счёт переработки UDPG, катализируемого сахаросинтазой AtSuSy. В данном исследовании YojK-I241T/G327N представлен как перспективный инструмент для экономически эффективного промышленного производства Reb D.
