Оптимизация условий реакции для достижения высокого выхода стевии Ребаудиозид D
Диеты с высоким содержанием сахара привели к росту распространенности различных хронических заболеваний, включая ожирение, диабет, сердечно-сосудистые заболевания и гипертонию, что представляет собой серьезную глобальную проблему общественного здравоохранения. Стевия Ребаудиозид D (Reb D), натуральный подсластитель, получаемый из растений, привлек значительное внимание в качестве заменителя сахара благодаря своей нулевой калорийности, интенсивной сладости и приятным вкусовым характеристикам.
Однако его ограниченное содержание в стевии ребаудиане Бертони и проблемы, связанные с низкой растворимостью и ферментативной активностью растительных гликозилтрансфераз, препятствовали его широкому коммерческому применению. В ответ на эти проблемы был обнаружен новый гликозилтрансферазный фермент, названный YojK, происходящий из Bacillus subtilis 168. В этом исследовании представлен генетически модифицированный бактериальный гликозилтрансферазный фермент YojK-I241T/G327N, характеризующийся высокой растворимостью и каталитической эффективностью, что открывает большие возможности для промышленного производства Reb D.
Разработка высокоэффективного метода производства ребаудиозида D с использованием каскадной реакции ферментов YojK-I241T/G327N и AtSuSy.
Чтобы решить проблему низкой растворимости растительных гликозилтрансфераз, исследователи изучили возможность использования YojK, O-гликозилтрансферазы из Bacillus subtilis 168. YojK был выбран из-за его продемонстрированной гликозилирующей активности с различными субстратами, включая крупные молекулы. После успешной рекомбинантной экспрессии и очистки YojK был использован для гликозилирования Reb A, что привело к получению стевии Reb D. Кинетический анализ фермента показал, что YojK имеет более низкую каталитическую активность по отношению к Reb D по сравнению с другими гликозилтрансферазами. Следовательно, исследование предполагает необходимость структурно-направленной инженерии для повышения каталитической активности YojK для потенциального практического применения. (как показано на рисунке 1)
Рисунок 1
Оптимизация условий реакции для достижения высокого выхода ребаудиозида D.
Условия реакции, включая pH, температуру и концентрацию субстрата, могут быть оптимизированы для достижения высокого выхода стевии Reb D. В исследовании использовались методы молекулярной динамики для изучения того, как вариант YojK-I241T/G327N усиливает гликозилирование Reb D. Вариант поддерживал стабильную водородную связь между Reb A и H14 во время моделирования, в отличие от дикого типа (как показано на рисунке 2). Эта стабильность также распространялась на расстояние между атомом O2 Reb A и C1P UDPG. Улучшенная каталитическая эффективность варианта YojK-I241T/G327N была объяснена этими стабильными взаимодействиями, что предполагает его практический потенциал.
Рисунок 2
Рисунок 3
Заключение
Этот подход позволил получить 83,47% Reb D. Примечательно, что добавление 1 мМ UDPG позволило синтезировать 20,59 г/л Reb D с замечательным выходом 91,29%, что превосходит предыдущие исследования. Этот процесс демонстрирует потенциал для промышленного производства Reb D, особенно после структурной инженерии YojK.YojK может быть эффективно экспрессирован в E. coli BL21 (DE3) с высокой растворимостью. Благодаря структурно-направленной инженерии был создан двойной мутант YojK-I241T/G327N, позволяющий осуществлять крупномасштабное производство Reb D с исключительным выходом 91,29% за счет рециркуляции UDPG, катализируемой сахарозосинтазой AtSuSy. Это исследование представляет YojK-I241T/G327N как многообещающий инструмент для экономически эффективного промышленного производства Reb D.
