Инженерия ферментов, связанных с ростом, через манипуляцию регенерацией редокс-кофакторов

Всё более широкий спектр химикатов сейчас производится из возобновляемого сырья с помощью биотехнологических средств. Биопроцессы в значительной степени зависят от ферментативного катализа для эффективного производства этих соединений. Обеспечение оптимальной эффективности ферментов в необходимой среде представляет большой интерес для устойчивого производства.

Свойства, такие как специфичность субстрата, каталитическая скорость и (термо)стабильность, являются одними из нескольких критически важных факторов, которые необходимо оптимизировать для эффективных ферментируемых биопроцессов. Эта оптимизация может быть трудоёмкой, дорогостоящей и сложной, а значит, эффективным и экономически эффективным способом отбора с помощью роста, поэтому инженерные ферменты с желательных характеристик пользуются большим спросом.

Преимущества использования росто-связанного отбора как формы отбора ферментов, которая связывает активность фермента с ростом клетки. Этот метод может использоваться как стратегия отбора с высокой пропускной способностью и достигается либо путем зависимости роста от синтеза продукта целевым ферментом, либо связывая активность фермента с глобальным энергетическим состоянием клетки. Синтетическая биология может использоваться для создания штамм, подходящих для отбора с помощью роста, и последние достижения сосредоточены на инженерных штаммах с дефицитом окисленных или восстановленных состояний пар редокс-кофакторов, которые могут служить платформами для инженерии ферментов. Использование этих платформ может ускорить разработку улучшенных биокатализаторов и биопроцессов.

Преимущества сцепления роста с помощью кофакторной ауксотрофии

Преимущества использования кофакторной ауксотрофии как метода отбора для инженерии ферментов, участвующих в биосинтезе определённых химических веществ, таких как липиды, биотопливо, газы, органические растворители или полимерные соединения. Этот подход предлагает несколько уникальных преимуществ, включая возможность самостоятельно выбирать желаемый продукт независимо от интересующего субстрата или продукта, что облегчает выявление улучшенной ферментативной активности и предоставляет индикатор для выявления улучшенной ферментативной активности. Кроме того, использование кофакторных ауксотрофов в качестве платформ для связывания роста полезно, поскольку повсеместная природа редокс-кофакторов в микробном метаболизме позволяет инженерные стратегии быть латерально переносимыми другим интересующими микробами, а ферменты могут быть непосредственно инженерны в окружающей среде желаемого микробного хозяина. (показано как рисунок 1)

Рисунок 1: Сравнение нескольких широко используемых методов скрининга/селекции для инженерии ферментов

Мутанты с дефицитом окисления NADH

Окисление NADH в E. coli может происходить двумя путями, в зависимости от доступности кислорода. В аэробных условиях NADH в основном окисляется дыханием для образования АТФ, тогда как в анаэробных условиях он может окисляться через пути ферментации для образования лактата и этанола. Мутантные штаммы E. coli, не способные использовать смешанные пути брожения для окисления NADH во время анаэробного роста, использовались для управления NADH окисляющими путями для анаэробного синтеза различных химических веществ, таких как 2-метилпропан-1-ол, 2,3-бутандиол, 1-бутанол и L-аланин. Эти мутантные штаммы также использовались для создания ферментов с использованием схожих окислительно-восстановительных принципов, что привело к улучшению вариантов. Полученные штаммы могут использоваться для создания других ферментов и путей, зависящих от NAD(P)H.

Мутанты с дефицитом NAD+  

Венк и др. создали штамм E. coli, удалив ген дигидролипойлдегидрогеназы (LPD), что привело к тому, что штамм не мог генерировать восстанавливающую способность (NADH и NADPH) при метаболизме ацетата из-за отсутствия активности пируватдегидрогеназы. Это приводило к тому, что штамм проявляет ауксотрофию для снижения мощности при аэробном выращивании на ацетате как единственном источнике углерода. (показано на рисунке 2) Штамм мог расти на ацетате при добавлении верхних гликолитических субстратов или при экспрессии NAD+-зависимых формито-, этанол- или метанолдегидрогеназ, используя соответствующие субстраты. Штамм не использовался для ферментной инженерии и оценивался только на ауксотрофию редокс-кофактора.
 

Рисунок 2: Центральный метаболизм 

Мутанты с дефицитом окисления NADPH

Существуют две различные стратегии для индуцирования NADP+ ауксотрофии у кишечной палочки, основанных на инженерии гликолитического пути для чрезмерного производства NADPH. Первая стратегия заключается в удалении нативного гена gapA и экспрессии гетерологичного фермента GAPDH, зависящего от NADP+, а вторая — перенаправление потока углерода через путь пентозофосфата. Полученные штаммы не способны расти на глюкозе, но демонстрируют рост в разных условиях: первый штамм выращивается в анаэробных условиях, второй — в аэробных условиях с глицеролом в качестве субстрата. Эти штаммы используются для создания ферментов с улучшенными свойствами, включая специфичность субстрата, каталитическую активность и термостабильность.

Мутанты с дефицитом восстановления NADP+

Три различных бактерии — E. coli, P. putida и C. glutamicum — были модифицированы так, чтобы быть NADPH-ауксотрофными, то есть им требуется экзогенный NADPH для роста. В случае E. coli и C. glutamicum центральные метаболические ферменты были выведены из строя, чтобы избежать снижения NADP+, когда глюкоза предоставлялась как источник углерода, тогда как у P. putida использовалась инженерия с помощью CRISPR/nCas9 для последовательного нарушения множества целевых генов с целью понимания их участия в редокс-метаболизме. Затем NADPH-ауксотрофные штаммы использовались для инженерии ферментов с ростовой связью на основе специфичности кофакторов. Один раунд мутагенеза с использованием E. coli дал на сегодняшний день наиболее эффективную и специфическую формиотдегидрогеназу с зависимостью от NADP+, в то время как P. putida и C. glutamicum представляют собой первые штаммы своего вида, которые могут быть использованы для такого типа инженерии.

Мутанты с дефицитом NMN+

Была разработана система отбора, связанная с ростом, связывающая циклы и рост кофакторов на основе дефицита снижения NMN+. Использовался штамм E. coli SHuffle, который несёт делеции в двух генах, участвующих в выработке редуцированного глутатиона. NMNH-зависимая глутатионредуктаза была разработана методом рационального мутагенеза для связи процесса с циклом NMN+/NMNH, а также NMN+-зависимая глюкозо-дегидрогеназа для поддержки циклов кофакторов NMN+/NMNH и, соответственно, роста. В исследовании также впервые применили неканоническую окислительно-кофакторную ауксотрофию для ферментной инженерии с ростом, что привело к созданию термостабильного варианта фосфитдегидрогеназы с повышенной каталитической эффективностью и временной стабильностью in vitro. Работа предоставляет полезный вариант для инженерии ферментов, связанных с ростом, зависящего от циклирования NMN+/NMNH и ауксотрофного для восстановления состояния неканонического окислительно-кофактора.

Потенциал сцепления роста с помощью редокс-кофакторов служил мощным инструментом для создания биокатализаторов, особенно в контексте устойчивого биопроизводства. Хотя достигнут значительный прогресс в создании редокс-кофакторных ауксотрофных штамм, заявление свидетельствует о том, что существует несколько неизведанных направлений для исследований. Одна из них связана с разработкой кофакторных ауксотрофных штаммов организмов, отличных от E. coli, что может открыть новые возможности для инженерии ферментов, связанных с ростом.

В целом, это свидетельствует о том, что использование окислительно-кофакторного ростового соединения представляет собой значительную возможность для инженерного биокатализа, особенно для производства продуктов, которые не могут удовлетворить требования других высокопроизводительных методов ферментной инженерии. В нём подчеркивается необходимость разработки более универсальных и эффективных биокатализаторов для устойчивого биопроизводства и подчёркивает важность продолжения исследований в этой области.


Ссылка: Jochem R. Nielsen a, Рууд А. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Инженерия ферментов, связанных с ростом через манипуляцию регенерацией редокс-кофакторов, Biotechnology Advances, 2023.