Инженерия ферментов, сопряженная с ростом, путем манипулирования регенерацией редокс-кофакторов

Всё более широкий спектр химических веществ в настоящее время производится из возобновляемого сырья биотехнологическими методами. Биопроцессы в значительной степени зависят от ферментативного катализа для эффективного производства этих соединений. Поэтому обеспечение оптимальной работы ферментов в требуемой среде представляет большой интерес для устойчивого производства.

Такие свойства, как субстратная специфичность, скорость катализа и (термо)стабильность, относятся к числу нескольких критических факторов, которые необходимо оптимизировать для эффективных ферментативных биопроцессов. Эта оптимизация может быть трудоёмкой, дорогостоящей и сложной, поэтому эффективные и экономически выгодные способы, вероятно, для сопряжённого с ростом отбора, инженерии ферментов с желаемыми характеристиками пользуются большим спросом.

Преимущества использования сопряжённого с ростом отбора как формы отбора ферментов, который включает связывание активности фермента с ростом клетки. Этот метод может использоваться как стратегия высокопроизводительного отбора и может быть достигнут либо путём обеспечения зависимости роста от синтеза продукта целевым ферментом, либо путём связывания активности фермента с глобальным энергетическим состоянием клетки. Синтетическая биология может быть использована для конструирования штаммов, подходящих для сопряжённого с ростом отбора, а недавние достижения были сосредоточены на конструировании штаммов с дефицитом окисленных или восстановленных состояний пар редокс-кофакторов, которые могут служить платформами для инженерии ферментов. Использование этих платформ может ускорить разработку улучшенных биокатализаторов и биопроцессов.

Преимущества сопряжения роста с ауксотрофностью по кофактору

Преимущества использования ауксотрофности по кофактору как метода отбора для инженерии ферментов, участвующих в биосинтезе определённых химических веществ, таких как липиды, биотоплива, газы, органические растворители или полимерные соединения. Этот подход предлагает несколько уникальных преимуществ, включая возможность отбирать желаемый продукт независимо от субстрата или продукта, представляющего интерес, что облегчает обнаружение улучшенной ферментативной активности и обеспечивает считываемый сигнал для обнаружения улучшенной ферментативной активности. Кроме того, использование ауксотрофов по кофактору в качестве платформ сопряжения роста выгодно, потому что повсеместное распространение редокс-кофакторов в микробном метаболизме означает, что стратегии инженерии могут быть латерально переносимы на другие представляющие интерес микробы, и ферменты могут быть непосредственно сконструированы в среде желаемого микробного хозяина. (показано на рисунке 1)

Рисунок 1: Сравнение нескольких широко используемых методов скрининга/отбора для инженерии ферментов

Мутанты с дефицитом окисления НАДН

Окисление НАДН в E. coli может происходить двумя путями, в зависимости от доступности кислорода. В аэробных условиях НАДН в основном окисляется через дыхание с образованием АТФ, тогда как в анаэробных условиях он может окисляться через пути брожения с образованием лактата и этанола. Мутантные штаммы E. coli, неспособные использовать смешанные пути брожения для окисления НАДН во время анаэробного роста, были использованы для стимулирования НАДН-окисляющих путей для анаэробного синтеза различных химических веществ, таких как 2-метилпропан-1-ол, 2,3-бутандиол, 1-бутанол и L-аланин. Эти мутантные штаммы также были использованы для инженерии ферментов с использованием аналогичных редокс-принципов, что привело к улучшенным вариантам. Полученные штаммы могут быть использованы для инженерии других НАД(Ф)Н-зависимых ферментов и путей.

Мутанты с дефицитом восстановления НАД+

Венк и др. создали штамм E. coli путём делеции гена дигидролипоилдегидрогеназы (lpd), что привело к неспособности штамма генерировать восстановительную силу (НАДН и НАДФН) из метаболизма ацетата из-за отсутствия активности пируватдегидрогеназы. Это вызвало у штамма ауксотрофность по восстановительной силе при аэробном росте на ацетате как единственном источнике углерода. (показано на рисунке 2) Штамм был способен расти на ацетате при добавлении верхних гликолитических субстратов или при экспрессии НАД+-зависимых формиат-, этанол- или метанолдегидрогеназ с их соответствующими субстратами. Штамм не использовался для инженерии ферментов и был оценён только на ауксотрофность по редокс-кофактору.
 

Рисунок 2: Центральный метаболизм

Мутанты с дефицитом окисления НАДФН

Существуют две различные стратегии индукции ауксотрофности по НАДФ+ в E. coli, основанные на конструировании гликолитического пути для сверхпродукции НАДФН. Первая стратегия включает делецию нативного гена gapA и экспрессию гетерологичного НАДФ+-зависимого фермента ГАФДГ, тогда как вторая стратегия включает перенаправление углеродного потока через пентозофосфатный путь. Полученные штаммы неспособны расти на глюкозе, но проявляют рост в различных условиях: первый штамм растёт в анаэробных условиях, а второй — в аэробных условиях с глицерином в качестве субстрата. Эти штаммы используются для инженерии ферментов с улучшенными свойствами, включая субстратную специфичность, каталитическую активность и термостабильность.

Мутанты с дефицитом восстановления НАДФ+

Три различные бактерии, E. coli, P. putida и C. glutamicum, были сконструированы как НАДФН-ауксотрофные, что означает, что они требуют экзогенный НАДФН для роста. В случае E. coli и C. glutamicum центральные метаболические ферменты были нокаутированы, чтобы избежать восстановления НАДФ+ при использовании глюкозы в качестве источника углерода, тогда как в P. putida использовалась инженерия с помощью CRISPR/nCas9 для последовательного нарушения наборов целевых генов, чтобы понять их участие в редокс-метаболизме. НАДФН-ауксотрофные штаммы затем использовались для сопряжённой с ростом инженерии ферментов на основе кофакторной специфичности. Один раунд мутагенеза с использованием E. coli дал наиболее эффективную и специфичную НАДФ+-зависимую формиатдегидрогеназу на сегодняшний день, тогда как P. putida и C. glutamicum представляют собой первые штаммы своих видов, которые могут быть использованы для этого типа инженерии.

Мутанты с дефицитом восстановления НМН+

Была разработана система отбора, сопряжённого с ростом, для связывания циклирования кофактора и роста на основе дефицита восстановления NMN+. Использовался штамм E. coli SHuffle, несущий делеции в двух генах, участвующих в продукции восстановленного глутатиона. Путём рационального мутагенеза была создана NMNH-зависимая глутатионредуктаза для связывания процесса с циклированием NMN+/NMNH, а NMN+-зависимая глюкозодегидрогеназа использовалась для поддержки циклирования кофактора NMN+/NMNH и, следовательно, роста. В исследовании также впервые была применена ауксотрофность по неканоническому окислительно-восстановительному кофактору для инженерии ферментов, сопряжённой с ростом, что привело к получению термостабильного варианта фосфитдегидрогеназы с улучшенной каталитической эффективностью и временной стабильностью in vitro. Работа предоставляет полезный штамм для инженерии ферментов, сопряжённой с ростом, зависящий от циклирования NMN+/NMNH и ауксотрофный по восстановленной форме неканонического окислительно-восстановительного кофактора.

Потенциал сопряжения роста через окислительно-восстановительные кофакторы оказался мощным инструментом для инженерии биокатализаторов, особенно в контексте устойчивого биопроизводства. Несмотря на значительный прогресс в создании штаммов, ауксотрофных по окислительно-восстановительным кофакторам, утверждение предполагает, что всё ещё существует несколько неизученных направлений исследований. Одно из них включает инженерию кофактор-ауксотрофных штаммов организмов, отличных от E. coli, что может открыть новые возможности для инженерии ферментов, сопряжённой с ростом.

В целом, это предполагает, что использование сопряжения роста на основе окислительно-восстановительных кофакторов представляет собой значительную возможность для инженерии биокатализа, особенно для производства продуктов, которые не могут удовлетворить требования других высокопроизводительных подходов к инженерии ферментов. Это подчёркивает необходимость разработки более универсальных и эффективных биокатализаторов для устойчивого биопроизводства и подчёркивает важность продолжения исследований в этой области.


Ссылка: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.