Инженерия ферментов, связанных с ростом посредством манипулирования регенерацией окислительно-восстановительного кофактора

В настоящее время все более широкий спектр химических веществ производится из возобновляемого сырья с помощью биотехнологических средств. Биопроцессы в значительной степени зависят от ферментативного катализа для эффективного производства этих соединений. Таким образом, обеспечение оптимальной работы ферментов в требуемой среде представляет большой интерес для устойчивого производства.

Такие свойства, как специфичность субстрата, скорость каталитического каталитического эффекта и (термо)стабильность, являются одними из нескольких критических факторов, которые должны быть оптимизированы для эффективных биопроцессов, управляемых ферментами. Эта оптимизация может быть трудоемкой, дорогостоящей и сложной, и поэтому эффективные и экономичные способы, вероятные для селекции, связанной с ростом, инженерные ферменты с желаемыми характеристиками пользуются большим спросом.

Преимущества использования связанного с ростом отбора как формы ферментного отбора, который включает в себя связывание активности фермента с ростом клетки. Этот метод может быть использован в качестве высокопроизводительной стратегии отбора и может быть достигнут либо путем обеспечения зависимости роста от синтеза продукта целевым ферментом, либо путем связывания активности фермента с глобальным энергетическим состоянием клетки. Синтетическая биология может быть использована для создания штаммов, пригодных для селекции, связанной с ростом, а недавние достижения были сосредоточены на создании штаммов с дефицитом окисленных или восстановленных состояний окислительно-восстановительных пар кофакторов, которые могут служить платформами для ферментной инженерии. Использование этих платформ может ускорить разработку усовершенствованных биокатализаторов и биопроцессов.

Преимущества связи роста с помощью кофакторной ауксотрофии

Преимущества использования кофакторной ауксотрофии в качестве метода отбора инженерных ферментов, участвующих в биосинтезе определенных химических веществ, таких как липиды, биотопливо, газы, органические растворители или полимерные соединения. Этот подход предлагает несколько уникальных преимуществ, в том числе возможность выбора желаемого продукта независимо от интересующего субстрата или продукта, что упрощает обнаружение улучшенной ферментативной активности и предлагает показания для обнаружения улучшенной ферментативной активности. Кроме того, использование ауксотрофов кофакторов в качестве платформ для спаривания роста выгодно, поскольку повсеместная природа окислительно-восстановительных кофакторов в микробном метаболизме означает, что инженерные стратегии могут быть перенесены на другие интересующие микробы, а ферменты могут быть непосредственно спроектированы в среде желаемого микроба-хозяина. (показано на рисунке 1)

Рисунок 1: Сравнение нескольких широко используемых методов скрининга/отбора для ферментной инженерии

Мутанты с дефицитом окисления НАДН

Окисление НАДН в кишечной палочке может происходить двумя путями, в зависимости от наличия кислорода. В аэробных условиях НАДН в основном окисляется через дыхание с образованием АТФ, в то время как в анаэробных условиях он может окисляться через пути ферментации с образованием лактата и этанола. Мутантные штаммы E. coli, неспособные использовать смешанные пути ферментации для окисления NADH во время анаэробного роста, были использованы для управления окислительными путями NADH для анаэробного синтеза различных химических веществ, таких как 2-метилпропан-1-ол, 2,3-бутандиол, 1-бутанол и L-аланин. Эти мутантные штаммы также использовались для создания ферментов, используя аналогичные окислительно-восстановительные принципы, что привело к улучшению вариантов. Полученные штаммы могут быть использованы для создания других NAD(P)H-зависимых ферментов и путей.

Мутанты с дефицитом снижения НАД+  

Wenk et al. создали штамм E. coli путем удаления гена дигидролипоилдегидрогеназы (lpd), что привело к тому, что штамм не смог генерировать восстановительную энергию (NADH и NADPH) от метаболизма ацетата из-за отсутствия активности пируватдегидрогеназы. Это привело к тому, что штамм проявил ауксотрофию для снижения мощности при аэробном выращивании на ацетате в качестве единственного источника углерода. (показано на рисунке 2) Штамм был способен расти на ацетате при добавлении верхних гликолитических субстратов или при экспрессии НАД+-зависимых формиат-, этано- или метанолдегидрогеназ с соответствующими субстратами. Штамм не использовался для ферментной инженерии и оценивался только на окислительно-восстановительный кофактор ауксотрофию.
 

Рисунок 2: Центральный метаболизм 

Мутанты с дефицитом окисления НАДФН

Существует две различные стратегии индуцирования ауксотрофии НАДФ+ у E. coli, основанные на разработке гликолитического пути для перепроизводства НАДФН. Первая стратегия включает удаление нативного гена gapA и экспрессию гетерологичного НАДФ+-зависимого фермента GAPDH, в то время как вторая стратегия включает перенаправление потока углерода через пентозофосфатный путь. Полученные штаммы не могут расти на глюкозе, но демонстрируют рост в различных условиях, причем первый штамм выращивается в анаэробных условиях, а второй — в аэробных условиях с глицерином в качестве субстрата. Эти штаммы используются для создания ферментов с улучшенными свойствами, включая субстратную специфичность, каталитическую активность и термостабильность.

Мутанты с дефицитом снижения уровня НАДФ+

Три различные бактерии, E. coli, P. putida и C. glutamicum, были спроектированы так, чтобы быть НАДФН-ауксотрофными, что означает, что им требуется экзогенная НАДФН для роста. В случае E. coli и C. glutamicum центральные метаболические ферменты были нокаутированы, чтобы избежать снижения НАДФ+, когда глюкоза была предоставлена в качестве источника углерода, в то время как у P. putida была использована инженерия с помощью CRISPR/nCas9 для последовательного разрушения наборов генов-мишеней, чтобы понять их участие в окислительно-восстановительном метаболизме. Затем НАДФН-ауксотрофные штаммы использовали для ферментной инженерии, связанной с ростом, на основе специфичности кофактора. Один раунд мутагенеза с использованием E. coli позволил получить наиболее эффективную и специфичную на сегодняшний день НАДФ+-зависимую формиатдегидрогеназу, в то время как P. putida и C. glutamicum представляют собой первые штаммы своего вида, которые могут быть использованы для этого типа инженерии.

Мутанты с дефицитом снижения NMN+

Была разработана система отбора, связанная с ростом, чтобы связать цикличность кофактора и рост на основе дефицита снижения NMN+. Использовали штамм E. coli SHuffle, который несет делеции в двух генах, участвующих в выработке восстановленного глутатиона. NMNH-зависимая глутатионредуктаза была разработана путем рационального мутагенеза, чтобы связать этот процесс с циклом NMN+/NMNH, а NMN+-зависимая глюкозодегидрогеназа была использована для поддержки цикла кофактора NMN+/NMNH и, следовательно, роста. В исследовании также впервые была применена неканоническая окислительно-восстановительная кофакторная ауксотрофия для ферментной инженерии, связанной с ростом, в результате чего был получен термостабильный вариант фосфитдегидрогеназы с улучшенной каталитической эффективностью и временной стабильностью in vitro. В работе представлен полезный штамм для ферментной инженерии, связанной с ростом, зависящий от цикла NMN+/NMNH и ауксотрофный для редуцированного состояния неканонического окислительно-восстановительного кофактора.

Потенциал связи роста с помощью окислительно-восстановительных кофакторов стал мощным инструментом для разработки биокатализаторов, особенно в контексте устойчивого биопроизводства. Несмотря на значительный прогресс в создании окислительно-восстановительных кофакторных ауксотрофных штаммов, в заявлении говорится, что все еще существует несколько неисследованных направлений для исследований. Один из них включает в себя создание кофакторных ауксотрофных штаммов организмов, отличных от E. coli, что может открыть новые возможности для ферментной инженерии, связанной с ростом.

В целом, это говорит о том, что использование ростовой связи на основе окислительно-восстановительного кофактора представляет собой большую возможность для инженерного биокатализа, особенно для производства продуктов, которые не могут удовлетворить требования других высокопроизводительных подходов к ферментной инженерии. В нем подчеркивается необходимость разработки более универсальных и эффективных биокатализаторов для устойчивого биопроизводства и подчеркивается важность продолжения исследований в этой области.


Ссылка: Йохем Р. Нильсен а, Рууд А. Вьюстхёйс б, Вэй Э. Хуан а, Ферментная инженерия с привязкой к росту посредством манипулирования регенерацией окислительно-восстановительного кофактора, Biotechnology Advances, 2023.