Количественная оценка НАД+ и его метаболитов в седалищных нервах мышей
10 апр 2024
Знакомство
Важнейшие роли никотинамидадениндинуклеотида (НАД+) и его метаболитов в старении и нейродегенерации получили широкое признание. Для стимулирования прогресса в биохимических исследованиях и вмешательствах, направленных на старение и нейродегенеративные заболевания, большое значение имеет точное количественное определение уровня НАД+ и его метаболитов в пути спасения НАД+. Здесь надежный и точный метод ЖХ-МС/МС применяется для количественного определения уровней НАД+ и его метаболитов в нормальном и поврежденном седалищном нерве мыши.Ограничения существующих методов количественного определения НАД+ и его метаболитов
Традиционные методы количественного определения НАД+ и его метаболитов, такие как ВЭЖХ-УФ, ЯМР, капиллярный зональный электрофорез или колориметрические ферментативные анализы, сталкиваются с различными проблемами в отношении чувствительности, селективности и косвенного измерения. Что касается существующих ЖХ-МС/МС анализов для измерения клеточного или тканевого НАД+ и его метаболитов, то здесь все еще существует много трудностей, которые необходимо преодолеть, такие как увеличенное время выполнения, плохое хроматографическое удержание и неудовлетворительная форма пиков. Более того, только от одного до трех веществ в пути спасения НАД+ могут быть охвачены этими методами.Модификации метода ЖХ-МС/МС
На основе существующих ЖХ-МС/МС анализов проводятся модификации хроматографических условий, суррогатной матрицы и условий МС/МС. В частности, 5 мкМ метиленфосфоновой кислоты используются в качестве добавки подвижной фазы, что значительно повышает интенсивность сигнала и форму пика. Учитывая относительно чистую и простую природу образцов Never и их небольшой размер, сверхчистая вода тестируется в качестве матрицы-заменителя. Вместо колонки жидкостной хроматографии с гидрофильным взаимодействием и колонки для гиперкарбюраторов используется колонка Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, уникальная высокоэффективная технология поверхности MaxPeak HPS (пассивация внутренней стенки колонки, устранение металлической поверхности) обеспечивает высокую воспроизводимость, пиковую симметрию и базовое разделение всех аналитов. Кроме того, условия МС оптимизированы для минимизации интерференционного сигнала NAD+ в канале циклической аденозиндифосфатрибозы (cADPR) при сохранении отклика cADPR и никотинамидмононуклеотида (NMN) с напряжением ионного распыления 4000 В, температурой турбонагревателя 450 °C, 50 фунтами на квадратный дюйм для газа 1, 50 фунтов на квадратный дюйм для газа 2, 30 фунтов на квадратный дюйм для завесы и 12 фунтов на квадратный дюйм для газа столкновения.
Репрезентативная хроматограмма образцов нервов (нормальные и поврежденные)
Все пять аналитов достигают исходного разделения, где cADPR является чувствительным биомаркером в модели нейродегенерации. При этом аксотомия седалищного нерва индуцирует аксональную дегенерацию, что приводит к снижению уровня НАД+ и повышению уровня НМН в поврежденных нервах, что приводит к увеличению соотношения НМН/НАД+ примерно в 2 раза. Одновременно уровни никотинамида (ДН) и аденозиндифосфат рибозы (АДПР) снижаются примерно в 2 раза, а уровень цАДПР увеличивается более чем в 8 раз. Эти результаты согласуются с результатами ранее опубликованных исследований, подтверждающих точность этого модифицированного метода LS-MS/MS в количественном определении НАД+ и его метаболитов.
Заключение
Этот модифицированный метод ЖХ-МС/МС обеспечивает эффективное базовое разделение НАД+, НМН, НАМ, АДПР и цАДПР в течение короткого времени в 5 минут, что способствует ранней диагностике различных неврологических расстройств и разработке лекарств для старения и нейродегенеративных заболеваний.Ссылка
Ма Ю., Дэн Л., Ду З. Разработка и валидация метода ЖХ-МС/МС для количественного определения НАД+ и связанных с ним метаболитов в седалищных нервах мышей и его применение к животной модели с повреждением нерва. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821БОНТАК НАД
С 2012 года BONTAC занимается исследованиями и разработками, производством и продажей сырья для коэнзимов и натуральных продуктов, имея собственные заводы, более 170 глобальных патентов, а также сильную команду по исследованиям и разработкам. BONTAC обладает богатым опытом в области исследований и разработок и передовыми технологиями в области биосинтеза NAD и его прекурсоров (например, NMN и NR). Существуют различные типы NAD для выбора, включая NAD ER Grade (удаление эндоксинов), NAD Grade I (IVD / пищевая добавка / косметический сырой порошок), NAD Grade II (API/промежуточные продукты) и NAD Grade IV (если есть более высокие требования к растворимости), которые могут быть предоставлены в виде лиофилизированного порошка или кристаллического порошка. Чистота BONTAC NAD может достигать более 98%.
