Количественная оценка NAD+ и его метаболиты в седалищных нервах мышей
Введение
Ключевые компоненты никотинамида адениндинуклеотида (NAD+) и его метаболитов в старении и нейродегенерации широко изучены. Для стимулирования прогресса в биохимических исследованиях и вмешательствах, направленных на старение и нейродегенеративные заболевания, крайне важно точное количественное определение уровней NAD+ и его метаболитов в пути спасения NAD+. Здесь применяется надёжный и точный метод LC-MS/MS для количественной оценки уровня NAD+ и его метаболитов в нормальном и повреждённом седалищном нерве мыши.Ограничения существующих методов количественной оценки NAD+ и его метаболитов
Традиционные методы количественной оценки NAD+ и его метаболитов, такие как ВЭЖХ-УФ, ЯМР, электрофорез капиллярной зоны или колориметрические ферментативные анализы, сталкиваются с различными трудностями в области чувствительности, селективности и косвенного измерения. Что касается существующих анализов LC-MS/MS для измерения клеточного или тканевого NAD+ и его метаболитов, всё ещё предстоит преодолеть множество трудностей, таких как удлинённое время работы, плохое хроматографическое удержание и неудовлетворительная форма пиков. Кроме того, с помощью этих методов можно охватить только одно-три вещества в пути спасения NAD+.Модификации метода LC-MS/MS
На основе существующих анализов LC-MS/MS проводятся модификации хроматографических условий, суррогатной матрицы и условий MS/MS. В частности, 5 мкм метиленфосфоновой кислоты используется в качестве мобильного фазового аддитива, что явно повышает интенсивность сигнала и форму пика. Учитывая относительно чистую и простую природу не-образцов и их небольшой размер, ультрачистая вода тестируется как заменяющая матрица. Вместо гидрофильной жидкостной хроматографии и гиперкарбологической колонки используется колонка Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, уникальная технология высокопроизводительной поверхности MaxPeak HPS (пассивация внутренней стенки колонны, устранение металлической поверхности) обеспечивает высокую воспроизводимость, пиковую симметрию и базовое разделение всех анализируемых веществ. Кроме того, условия MS оптимизированы для минимизации сигнала помех NAD+ в циклическом канале аденозиндифосфатного рибозы (cADPR) при сохранении отклика cADPR и никотинамид-мононуклеотида (NMN): 4000 В для ионных распыляющих напряжений, 450°C для температуры турбонагревателя, 50 psi для газа 1, 50 psi для газа 2, 30 psi для завесного газа и 12 psi для столкновения газа.
Репрезентативная хроматограмма образцов нервов (нормальные или повреждённые)
Все пять анализируемых веществ достигают базового разделения, где cADPR является чувствительным биомаркером в модели нейродегенерации. Здесь аксотомия седалищного нерва вызывает дегенерацию аксонов, что приводит к снижению уровня NAD+ и повышению уровня NMN в повреждённых нервах, что приводит примерно в 2 раза к увеличению соотношения NMN/NAD+. Одновременно уровни никотинамида (НАМ) и рибозы аденозиндифосфата (ADPR) снижаются примерно в 2 раза, а уровень cADPR увеличивается более чем в 8 раз. Эти результаты согласуются с ранее опубликованными исследованиями, подтверждающими точность этого модифицированного метода LS-MS/MS в количественной оценке NAD+ и его метаболитов.
Заключение
Этот модифицированный метод LC-MS/MS обеспечивает эффективное базовое разделение NAD+, NMN, NAM, ADPR и cADPR за короткое время в 5 минут, что способствует ранней диагностике различных неврологических расстройств и разработке лекарств для старения и нейродегенеративных заболеваний.Ссылка
Ma Y, Deng L, Du Z. Разработка и валидация метода LC-MS/MS для количественной оценки NAD+ и связанных метаболитов в седалищных нервах мышей и его применение к животной модели с повреждением нервов. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACс 2012 года занимается исследованиями и разработками, производством и продажей сырья для коферментов и натуральных продуктов, имея собственные заводы, более 170 мировых патентов, а также сильную команду исследований и разработок. BONTAC обладает богатым опытом в области исследований и разработок и передовых технологий в области биосинтезаNAD и его предшественники(например. NMN и NR). Существует множество типов NAD, которые можно выбрать, включая NAD ER Grade (удаление эндоксинов), NAD Grade I (IVD/пищевые добавки/косметические сырые порошки), NAD Grade II (API/промежуточные препараты) и NAD Grade IV (если требуется более высокие требования к растворимости), которые могут предоставляться в виде лиофилизированного порошка или кристаллического порошка. Чистота BONTAC NAD может превышать 98%.
