Количественное определение NAD+ и его метаболитов в седалищных нервах мышей
Введение
Ключевая роль никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) и его метаболитов в старении и нейродегенерации широко признана. Для стимулирования прогресса в биохимических исследованиях и вмешательствах, направленных на старение и нейродегенеративные заболевания, большое значение имеет точное количественное определение NAD+ и его метаболитов в пути спасения NAD+. Здесь применяется надежный и точный метод LC-MS/MS для количественного определения NAD+ и его метаболитов в нормальном и поврежденном седалищном нерве мыши.Ограничения существующих методов количественного определения NAD+ и его метаболитов
Традиционные методы количественного определения NAD+ и его метаболитов, такие как ВЭЖХ-УФ, ЯМР, капиллярный зонный электрофорез или колориметрические ферментативные анализы, сталкиваются с различными проблемами чувствительности, селективности и косвенного измерения. Что касается существующих LC-MS/MS анализов для измерения NAD+ и его метаболитов в клетках или тканях, все еще остается много трудностей, которые необходимо преодолеть, таких как длительное время анализа, плохое хроматографическое удерживание и неудовлетворительная форма пиков. Более того, эти методы могут охватывать только от одного до трех веществ в пути спасения NAD+.Модификации метода LC-MS/MS
На основе существующих LC-MS/MS анализов проводятся модификации хроматографических условий, суррогатной матрицы и условий МС/МС. В частности, 5 мкМ метиленфосфоновой кислоты используется в качестве добавки к подвижной фазе, что явно улучшает интенсивность сигнала и форму пика. Учитывая относительно чистую и простую природу образцов нервов и их небольшой размер, ультрачистая вода тестируется в качестве заменяющей матрицы. Вместо колонки для гидрофильной хроматографии и колонки Hypercarb используется колонка Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, уникальная технология MaxPeak HPS с высокоэффективной поверхностью (пассивирование внутренней стенки колонки, устранение металлической поверхности) обеспечивает высокую воспроизводимость, симметрию пиков и базовое разделение всех аналитов.Кроме того, условия МС оптимизированы для минимизации интерференционного сигнала NAD+ в канале циклической аденозиндифосфат-рибозы (цАДФР) при сохранении ответа цАДФР и никотинамидмононуклеотида (НМН), с напряжением ионного распыления 4000 В, температурой турбонагревателя 450°C, давлением газа 1 50 фунтов на кв. дюйм, газа 2 50 фунтов на кв. дюйм, занавесного газа 30 фунтов на кв. дюйм и газа соударений 12 фунтов на кв. дюйм.
Репрезентативная хроматограмма образцов нервов (нормальный и поврежденный)
Все пять аналитов достигают базового разделения, где цАДФР является чувствительным биомаркером в модели нейродегенерации. Здесь аксотомия седалищного нерва индуцирует аксональную дегенерацию, приводящую к снижению уровня NAD+ и повышению уровня НМН в поврежденных нервах, что приводит к примерно 2-кратному увеличению соотношения НМН/NAD+. Одновременно уровни никотинамида (НАМ) и аденозиндифосфат-рибозы (АДФР) снижаются примерно в 2 раза, в то время как уровень цАДФР увеличивается более чем в 8 раз. Эти результаты согласуются с результатами ранее опубликованных исследований, подтверждая точность этого модифицированного метода ЖХ-МС/МС для количественного определения NAD+ и его метаболитов.
Заключение
Этот модифицированный метод LC-MS/MS обеспечивает эффективное базовое разделение NAD+, НМН, НАМ, АДФР и цАДФР в течение короткого времени анализа 5 минут, что способствует ранней диагностике различных неврологических расстройств и разработке лекарств для старения и нейродегенеративных заболеваний.Ссылка
Ma Y, Deng L, Du Z. Разработка и валидация метода LC-MS/MS для количественного определения NAD+ и связанных метаболитов в седалищных нервах мышей и его применение в модели повреждения нерва у животных. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACзанимается исследованиями и разработками, производством и продажей сырья для коферментов и натуральных продуктов с 2012 года, имеет собственные заводы, более 170 мировых патентов и сильную команду исследователей. BONTAC имеет богатый опыт в области исследований и разработок и передовые технологии в биосинтезеNAD и его предшественников(например, NMN и NR). Существуют различные типы NAD на выбор, включая NAD ER Grade (удаление эндотоксинов), NAD Grade I (сырьевой порошок для IVD/диетических добавок/косметики), NAD Grade II (API/промежуточные продукты) и NAD Grade IV (если есть более высокие требования к растворимости), которые могут быть предоставлены в форме лиофилизированного порошка или кристаллического порошка. Чистота BONTAC NAD может достигать более 98%.
